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如何應(yīng)對(duì)植物組培過程中的污染問題？新型高效方法值得推薦

植物組織培養(yǎng)是20世紀(jì)初發(fā)展起來的一門新興技術(shù)，隨著這項(xiàng)技術(shù)的日益完善，其應(yīng)用也越來越廣泛。但是在組織培養(yǎng)過程中，常常會(huì)遇到污染問題使實(shí)驗(yàn)無法進(jìn)行下去，甚至導(dǎo)致整個(gè)實(shí)驗(yàn)失敗，給科研和工廠化生產(chǎn)帶來損失。

污染是指在植物組織培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料滋生雜菌，最終導(dǎo)致培養(yǎng)失敗的現(xiàn)象。常見的污染類型包括：由霉菌引起的真菌性污染、多由外植體帶菌引起的細(xì)菌性污染、長(zhǎng)期多次繼代引起的內(nèi)生菌污染以及農(nóng)桿菌污染等。面對(duì)植物組培污染問題，我們通常采取在培養(yǎng)基中加入適量的抗生素（如青霉素、鏈霉素、氯霉素等）來抑菌。但是抗生素一般不穩(wěn)定，遇酸、堿或加熱都易分解而失去活性。而且單一抗生素抑菌容易產(chǎn)生抗藥性，一旦停止使用，污染率就會(huì)顯著上升。同時(shí)，高濃度的抗生素會(huì)影響植物的生長(zhǎng)。

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為解決上述問題，我們推薦專業(yè)植物組培高效廣譜性抗菌劑PPM?，它可以有效預(yù)防和清除由于空氣、滅菌不徹底、交叉污染、外植體消毒等各種原因?qū)е碌闹参锝M培苗的真菌、細(xì)菌、內(nèi)生菌和農(nóng)桿菌污染?？梢约尤肱囵B(yǎng)基高溫滅菌；而且在合理使用劑量下，不會(huì)對(duì)植物的生長(zhǎng)產(chǎn)生任何影響。


使用方法如下：
1、常規(guī)污染預(yù)防用量：
一般推薦使用濃度為0.05%-0.2%（1L培養(yǎng)基中加入0.5-0.75ml PPM?）；愈傷增殖， 器官形成，胚性組織發(fā)育等使用濃度為0.05%-0.075%。
2、植物內(nèi)生菌污染處理：
?種子：PPM?不推薦用于直接處理含有大量的細(xì)菌或真菌孢子的種子滅菌；對(duì)于種子離體萌發(fā)，建議先采用傳統(tǒng)方法消毒，然后置于含 2-3%PPM?的全培養(yǎng)基礎(chǔ)鹽溶液中，輕輕攪拌4-12小時(shí)，此過程千萬不能添加Tween20和調(diào)節(jié)pH，處理完成以后直接插入含有 PPM?(草本植物0.05-0.1%，木本植物0.2%)的培養(yǎng)基里進(jìn)行培養(yǎng)。
外植體：：以 1cm 外植體為例，將外植體置于含 4-5%PPM?的全培養(yǎng)基礎(chǔ)鹽溶液中，輕輕攪拌4-12小時(shí)，此過程千萬不能添加 Tween20和調(diào)節(jié)pH，處理完成以后直接插入含有PPM?(草本植物 0.05-0.1%，木本植物0.2%)的培養(yǎng)基里進(jìn)行培養(yǎng)。
塊莖，球莖和鱗狀物的觀賞植物樣本：將其整體放入消毒劑中攪拌消毒處理以后， 用水沖洗干凈，將材料切成薄片，置于含 4-5%PPM?的全培養(yǎng)基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)液中，輕輕攪拌4-12小時(shí)，此過程千萬不能添加Tween20 和調(diào)節(jié)pH，處理完成以后無需沖洗直接插入含有 0.1-0.2%的PPM?的培養(yǎng)基里進(jìn)行培養(yǎng)。
3、如果厚的外植體、污染嚴(yán)重的植株、種子等樣本經(jīng)過以上處理仍得不到理想效果，可嘗試以下操作：
將材料浸泡在水中持續(xù)攪拌處理(松軟組織攪拌1小時(shí)，硬實(shí)組織攪拌2小時(shí))
將材料在含50%的PPM?全培養(yǎng)基礎(chǔ)鹽溶液中攪拌處理5-10分鐘，此過程千萬不能添加 Tween20 和調(diào)節(jié)pH
無需沖洗，將處理過的材料直接加入到培養(yǎng)基中即可。對(duì)于真菌污染，可在培養(yǎng)基中加入適當(dāng)濃度的PPM?。對(duì)于真菌細(xì)菌混合性污染，建議在培養(yǎng)的第一個(gè)月的培養(yǎng)基中加入0.05%-0.2%的PPM?
4、嚴(yán)重污染材料污染去除與搶救（重污染不超過一周）
將污染的材料至于流水中用軟刷刷洗，然后置于含50% PPM?的無菌水溶液中攪拌5-15分鐘；對(duì)于細(xì)菌或者混合性污染，建議使用 100% PPM?與 0.6g/L 的檸檬酸無菌水溶液按 1：1 混合的低 pH(2.8-3.2)的酸性溶液處理
處理后的材料無需清洗，直接插入含0.05%-0.25的PPM?的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至少一個(gè)月以上，其中前10天需要弱光培養(yǎng)
5、農(nóng)桿菌的去除
共培養(yǎng)以后，將樣本用無菌水清洗，然后將樣本浸沒在 100% PPM?（補(bǔ)充4X的培養(yǎng)基鹽溶液）中處理2分鐘，取出后用無菌紙吸干后并置于常用抗性培養(yǎng)基中培養(yǎng)，3 周后，更換到只含有0.05%-0.075% PPM?(無常用抗生素)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
注意事項(xiàng)：
在所有 PPM?消毒處理外植體的過程中，盡量保證容器的體積足夠大，并使外植體材料所有面積與含PPM的處理溶液充分接觸，以保證消毒效果；
如果外植體出現(xiàn)高度氧化現(xiàn)象，不要扔棄，大約50%的外植體在 4-6 周內(nèi)即可恢復(fù)
50% PPM? 的處理溶液可以重復(fù)使用但是不推薦，因?yàn)槭褂么螖?shù)和效果受外植體的體積與接種密度的影響。將50% PPM?的處理溶液保存在4oC可適當(dāng)延長(zhǎng)其活性，一般可使用不超過10次。如果必要，建議配制2份50% PPM?溶液，一份用于外植體消毒內(nèi)生菌污染，另一份用于消除“培養(yǎng)過程中”的輕度污染材料搶救，第二份溶液在每次處理過后需要用 0.2mm濾器過濾
如果50%PPM?溶液處理效果不理想，可采用100%PPM?溶液進(jìn)行處理，處理方法相同，但使用次數(shù)不得超過10次。




產(chǎn)品信息：

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產(chǎn)品已發(fā)表文獻(xiàn)：

  1. Miyazaki J, Tan BH, Errington SG.  Eradication of endophytic bacteria via treatment for axillary buds of Petunia hybrida using Plant Preservative Mixture (PPMTM). PCTOC. 2010;102(3):365-372.
  2. Miyazaki J, Tan BH, Errington SG, Kuo JS. Bacterial endophyte in Macropidiafuliginosa: its localisation and eradication from in vitro cultured basal-stem callus. Aust J Bot. 2011;59(4):363-368.
  3. Lata H, Chandra S, Khan IA, ElSohly MA. Propagation through alginate encapsulation of axillary buds of Cannabis sativa L. — an important medicinal plant.  Phys and Mol Biol of Plants. 2009;15(1):79-86. 4. Greer SP, Rinehart TA.  Dormancy and Germination In Vitro Response of Hydrangea macrophylla and Hydrangea paniculata Seed to Light, Cold-Treatment and Gibberellic Acid. J. Environ. Hort. 2010;28(1):41–47.
  4. Greer SP, Rinehart TA.  Dormancy and Germination In Vitro Response of Hydrangea macrophylla and Hydrangea paniculata Seed to Light, Cold-Treatment and Gibberellic Acid. J. Environ. Hort. 2010;28(1):41–47.
  5. Moghaddam S, et al. Optimization of an Efficient Semi-Solid Culture Protocol for Sterilization and Plant Regeneration of Centellaasiatica (L.) as a Medicinal Herb. Molecules. 2011;16(11): 8981-8991
  6. ?olgecen H, Koca U, Toker G. Influence of diff erent sterilization methods on callus initiation and production of pigmented callus in ArnebiadensifloraLedeb. Turk J Biol. 2011; 35:513-520
  7. Pouvreau J, et al. A high-throughput seed germination assay for root parasitic plants. Plant Methods 2013;9:32
  8. Marecik R, Bialas W, Cyplik P, Lawniczak L, Chrzanowski L. Phytoremediation Potential of Three Wetland Plant Species Toward Atrazine in Environmentally Relevant Concentrations. Pol. J. Environ. Stud. 2012;21(3):697-702
  9. Pérez Flores J, Aguilar Vega ME, Roca Tripepi R. Assays for the in vitro establishment of Swietenia macrophylla and Cedrelaodorata. Rev. Colomb. Biotecnol. 2012;14(1)
  10. Nesterenko-Malkovskaya A, Kirzhner F, Zimmels Y, Armon R. Eichhorniacrassipes capability to remove naphthalene from wastewater in the absence of bacteria. Chemosphere. 2012;87(10):1186-1191.
  11. Kieffer M, Fuller MP. In Vitro Propagation of Cauliflower Using Curd Microexplants. Meth Mol Biol. 2013;994:329-339.
  12. Kodym A, Temsch E, Bunn E, Delpratt J. Ploidy stability of somatic embryo-derived plants in two ecological keystone sedge species (Lepidospermalaterale and L. concavum, Cyperaceae). Aust J Bot. 2012;60(5):396-404.
  13. Pe?a-Ramírez YJ, et al. Induction of somatic embryogenesis and plant regeneration in the tropical timber tree Spanish red cedar [Cedrelaodorata L. (Meliaceae)]. PCTOC. 2011;105(2):203-209.
  14. Haddadi F, Adb Aziz M, Saleh G. Abd Rashid A, Kamaladini H. Micropropagation of Strawberry cv. Camarosa: Prolific Shoot Regeneration from In Vitro Shoot Tips Using Thidiazuron with N6-benzylamino-purine. HortScience. 2010;45(3):453-456.
  15. Jimenez VM, Castillo J, Tavares E, Guevara E, Montiel M. In vitro propagation of the neotropical giant bamboo, Guadua angustifolia Kunth, through axillary shoot proliferation. PCTOC. 2006;86:389–395.
  16. Compton ME, Koch JM. Influence of Plant Preservative Mixture (PPM) on adventitous organogenesis in Melon, Petunia, and Tobacco. In Vitro Cell. Dev. Biol.- Plant. 2001;37:259-261

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